官方微信
开放非洲猪瘟自检后,猪场该如何操作?
来源 :未知   作者 :longbowang   发表时间 2019-04-22 10:01   浏览 :

 ——齐心协力 共抗非瘟,隆博旺畜牧为猪场保驾护航!
 

 

农业农村部:鼓励规模猪场和种猪场开展非洲猪瘟自检,并给予经费支持,并且鼓励委托兽医第三方检测!

 

近日,农业农村部办公厅发布《关于加强养殖环节非洲猪瘟疫情排查工作的通知》(以下简称《通知》)。《通知》提到,鼓励规模猪场和种猪场开展非洲猪瘟自检,强化疫情处置和阳性样品管理。期间,地方应给于适当经费支持,主动加强动物防疫设施建设。

 

以下探讨一下:养猪场该如何操作?供猪场朋友们参考。

 

对于养殖户来说,开放非洲猪瘟自检工作一定程度上使养户对于场内情况的把握更强,对于稳定养猪业的恐慌情绪也有一定帮助。对于非洲猪瘟的检测,不同规模的猪场应采取不同配套设备设施,现阶段主流诊断手段有两种:荧光定量PCR检测、快速检测试纸条。如果委托兽医第三方检测,也是可行性的。



 

问题来了,猪场到底选择哪种检测方案比较合适呢?首先我们分析一下两种非洲猪瘟检测手段的优缺点:

 

荧光定量PCR检测

优点:可以做到百分百检测准确率,敏感性高,可多样品混合检测,也可用于环境样本的检测;

缺点:检测操作复杂,需要配备专业人士,检测设备成本高;PCR时间较长,有的可超过一个小时,加上样品处理时间,一至两个小时内可能能出结果。致命问题:如果取样处理出问题,造成检测实验室污染,很难测底净化,会造成以后的检测结果准确率大打折扣。

 

快速诊断试纸条

优点:操作简便,采集疑是发病猪的全血及内脏组织即可,一个样品可供反复多卡检测来定性,同时可一次性采取群体不同阶段猪群对比检测。无需配备昂贵的设备,即可获得相应的检测信息,主要用于快速检测、初筛,特异性没问题,对于群体筛查比较有价值;

 

缺点:敏感性稍低,只能用于猪群感染病毒至少48小时以后从血液中才有可能检测到,如果是检测内脏组织估计还得往后推点时间,如需确认还得做实验室PCR检测;对于环境原料等检测不适用。

 

关于非洲猪瘟实验室诊断方法

其中国际贸易中,世界动物卫生组织(OIE)推荐的非洲猪瘟病原检测方法为PCR检测技术,血清学检测方法为ELISA(间接、阻断)检测技术。
 


 

图片来自中国农科院哈尔滨兽医研究所非洲猪瘟防控专家仇华吉研究员

 

关于非洲猪瘟检测2019年国家政策解读

我国的非洲猪瘟检测逐步走上正轨,从实验室规范、检测方法规范,到检测试剂盒研发报批,再到生猪产地检疫、屠宰、运输和猪肉制品企业提出了要求:

2019年1月2日农业农村部公告119号指出全面开展生猪屠宰及产品流通环节非洲猪瘟检测。

 

2019年1月2日农办牧 [2019] 3号文件《非洲猪瘟检测试剂盒有关事宜的通知》中提到动物检疫中对生猪及其肉产品开展非瘟病毒检测,使用符合要求的检测方法及试剂盒(试纸条),应急期间比对符合要求的试剂盒(试纸条)可使用至2019年6月30日。

 

2019年3月13日农牧发[2019] 7号《加强屠宰环节非洲猪瘟检测工作的通知》中指出屠宰企业开展自检,自建PCR实验室或委托实验室检测,并规定时限,要求生猪进场前以车为单位采集全部生猪血液样品,均匀混合后检测。

 

 

2019年4月12日,农办牧[2019] 39号《农业农村部办公厅加强养殖环节非洲猪瘟疫情排查工作的通知》农业农村部鼓励养殖场自行开展非洲猪瘟检测,鼓励养猪场户委托兽医社会化服务机构开展检测工作。



 

图片来源于农业部网站

 

小    结

对于一线猪场需要做到早、快、严、小(及时发现、快速反应、严格处置、减少损失),确诊后应第一时间“拔牙式”清除。非洲猪瘟是一种自然性“慢传播”的烈性传染病,只有在人为干扰(如频繁移动猪群,频繁清扫环境)的情况下才会加速该病的传播速度。由于该疾病的传播速度缓慢,潜伏期较长,一旦发现个体发病,往往大部分群体都已经发生了感染。所以,成功实现拔牙式清除的前提是准确、及时的早期诊断。快速检测试纸条相对准确性不高,荧光定量PCR作为早期诊断的检测方法成为了许多养殖场的不二选择!





 

图片来自中国农科院哈尔滨兽医研究所非洲猪瘟防控专家仇华吉研究员

 

隆博旺畜牧,齐心协力共抗非瘟为猪场保驾护航!

2018年12月,湖北隆博畜牧服务有限公司为升级服务模式,同养殖场一同打好非洲猪瘟疫情歼灭战,董事长孙群超携公司技术考察团一行来到湖南新南方养殖服务有限公司进行了实地考察,并就养猪服务商如何为广大养殖户提供更深入、方便、实时的技术服务进行了交流,达成深度合作。并引进新南方先进的兽医服务体系、新南方——国测生物便携式荧光定量PCR分析系统——猪警-2000,及相关检测试剂,为非瘟疫情期间猪场安全保驾护航。
 



隆博旺考察团一行参观湖南新南方—国测检测CMA认证兽医第三方诊断实验  

 

国测检测第三方诊断实验室的局部剪影

 

1、猪警-2000——便携式荧光定量PCR仪

“猪警-2000"是湖南国测生物科技有限公司推出的一款便携式四通道荧光定量PCR仪。具有体积小、功能强、速度快、检测灵敏度高、易操作、无需任何校正等优势。是国内目前最稳定的四通道荧光定量PCR仪。对于非洲猪瘟的检测方法(猪警-2000)符合中国动物疫病预防控制中心的比对要求。
 



猪警-2000产品性能参数

      

 

2、非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒

 

用国测生物的非洲猪瘟试剂盒,免提取,配猪警-2000,现地检测,操作简单,整个过程1小时,仪器自动分析出具报告。与OIE推荐的荧光PCR检测试剂的检测结果相符率达100%,具有敏感、特异、可重复的优点,可用于对临床样本中非洲猪瘟病毒DNA的特异性检测。
 


 

中国动物疫病预防控制中心出具的对比检测结果

 

免提取试剂盒操作流程




 

国测生物荧光PCR试剂盒产品特点

 

3、非洲猪瘟检测注意事项

3.1非洲猪瘟样品的采集、运输与保存要求

可采集发病动物或同群动物的血清样品和病原学样品,病原学样品主要包括抗凝血、脾脏、扁桃体、淋巴结、肾脏和骨髓等。如环境中存在钝缘软蜱,也应一并采集。

样品的包装和运输应符合农业农村部《高致病性动物病原微生物菌(毒)种或者样本运输包装规范》等规定。规范填写采样登记表,采集的样品应在冷藏密封状态下运输到相关实验室。
 

3.1.1血清样品

无菌采集5ml血液样品,室温放置12-24h,收集血清,冷藏运输。到达检测实验室后,冷冻保存。
 

3.1.2病原学样品
 

3.1.2.1抗凝血样品

无菌采集5ml乙二胺四乙酸抗凝血,冷藏运输。到达检测实验室后,-70℃冷冻保存。
 

3.1.2.2组织样品

首选脾脏,其次为扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓等,冷藏运输。样品到达检测实验室后,-70℃保存。
 

3.1.3钝缘软蜱

将收集的钝缘软蜱放入有螺旋盖的样品瓶/管中,放入少量土壤,盖内衬以纱布,常温保存运输。到达检测实验室后,-70℃冷冻保存或置于液氮中;如仅对样品进行形态学观察,可以放入 100%酒精中保存。

对于饲料、食槽水线、养殖环境、人员、器械及运输车辆也应施行严格检测,可采用洁净湿润的医用棉拭子随机、多点反复擦拭采样,低温运输或现场检测,做到无遗漏。
 

3.2实时荧光定量 PCR 实验注意事项

操作前应仔细阅读猪警-2000和检测试剂盒操作说明书。保证实验程序正确安装,实验操作准确无误。
 

3.2.1实验操作过程中的注意事项

①应该带一次性乳胶手套并经常更换,在试剂准备室和样本处理室应该配备负压式生物安全柜,以防止对环境或对样品的污染。

②要严格防止气溶胶交叉污染。

③荧光探针应该避光保存,加入反应液后应尽快上机,以防探针猝灭。

④在进行RNA相关操作时,必须使用无RNase的实验器具及耗材,并加样后立即上机操作,以防RNA的降解。

⑤所有试剂在开启之前都要瞬时离心;试剂配制完成后要瞬时离心以去除气泡。

⑥不要在荧光定量PCR管上做任何标记,不能直接用手接触PCR管上采光部位。
 

3.2.2无CT值或无扩增信号的问题及其解决方案

①实验的循环数不够,设计的循环数应该在35以上,可增加至45个循环,但不可高于45个循环。

②通道选择不对,应该仔细阅读产品说明书,根据说明书的要求选择采光通道。

③荧光采集位置设计有误,应该仔细阅读产品说明书,根据说明书的要求设置荧光信号采集位置。

④模板降解,尤其模板是RNA时很容易由于模板的降解而产生假阴性结果;可通过缩短样本提取和加样时间,加入RNA酶抑制剂等方法进行改进。

⑤加入样品中存在PCR抑制物。

⑥ PCR仪器故障,应先排除。

⑦样本中不存在对应模板或样本选择错误。
 

3.2.3实验中出现阴性抬头及其解决方案

①实验室气溶胶污染,严格按照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》进行实验室建设,在实验操作过程中严防汽溶胶的产生。

②标本交叉污染,通过规范实验操作防止。

③移液器使用引起的交叉污染,通过使用带滤芯吸头和规范移液器使用方法来防止。

 

3.2.4实验结果重复性差及其解决方案

①实验操作过程中加样不准确。

②有液体吸附在管壁上,通过瞬时离心解决。

③荧光定量PCR仪孔间温度不一致或孔间升降温不一致。

④荧光定量PCR管孔间均一性太差。

⑤模板浓度过低,模板浓度越低,实验重复性越差。
 

3.3 PCR实验室气溶胶污染的防范要点

 

3.3.1实验室气溶胶污染及其来源

气溶胶污染是指实验室在长期运行中,PCR产物不断积聚,附着在空气中的颗粒中,并悬浮于气体介质中形成的胶体分散体系,造成PCR检验的结果发生改变。
 


 

图片来源于网络

 

3.3.2实验室气溶胶防范措施

 

3.3.2.1应该施行实验室功能区严格区分,PCR实验室应该分别是试剂准备区、标本制备区、PCR扩增区、产物分析区,前两区为扩增前区,后两区为扩增后区。扩增前区与扩增后区应严格分开,同时配备通风与净化,形成科室之间的压差。
 


 

工作流向及空气流动方向

 

3.3.2.2设置对照,每次实验前均准备两个阴性对照(均以水作为模板,一个与样品参与核酸提取,另一个不参与提取,仅在配置扩增体系时加入),以便对实验室气溶胶污染情况进行监测。同时要设定一个阳性对照,用于监测实验结果的可靠性和准确性。

 

3.3.2.3实验室气溶胶监测,采用家用空气净化器定期对实验室空气进行净化,将净化器中的过滤网浸入水中,混匀后,以混合后的水作为样品进行相应检测,以便及时了解空气中气溶胶的污染情况。定期采集移液枪、提取仪、扩增仪等仪器内部及表面的棉拭子样品进行检测,以便了解实验仪器中的污染情况。


 

空气滤网(图片来源于网络)

 

3.3.2.4严格的工作流程,各功能区分别配备各自的工作服,可以以颜色区分,进入各科室必须更换相应的工作服;同时在洁净走廊入口配备PCR室专用鞋,进入必须更换,各科室前配备毡垫。洁净走廊中实验室人员只能从试剂准备区方向前往结果分析区方向,在条件允许的情况下各科室分别配备不同的人员进行操作,避免各科室人员互相窜动。

 

3.3.2.5加强清洁与消毒,做好实验室的清洁及消毒工作是防止实验室内发生气溶胶污染的有效途径。实验室的清洁范围包括工作台面(试验台、超净台和存储柜等)、仪器设备表面(离心机的转头、提取DNA用的加热块、扩增仪的样品槽、移液器杆的吸孔、遗传分析仪的加样槽等)、重复使用的工具或器皿等的清洁。

 

3.3.2.6提高实验室人员规范操作意识,定期组织实验室人员进行防污染安全培训,宣讲PCR实验室操作规范。

 

结束语

同时湖北隆博畜牧服务有公司还具备完善的售后服务保障和培训体系,包含从实验室建设规划到采样方案落实、实验室操作培训、实验室质量控制、样本保存、结果追溯等一整套的培训。

 

你还在等什么?

赶紧拨打热线联系吧~

18627023259尹 先 生

400-027-8869咨询热线